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실험 제목 : 플라스미드 DNA 분리
플라스미드 DNA 분리-Harvestingstep
플라스미드 DNA 분리-Resuspens ionstep
플라스미드 DNA 분리-Lys isstep
플라스미드 DNA 분리-Bindingstep
플라스미드 DNA 분리-Washstep
플라스미드 DNA 분리-Elution
플라스미드 DNA 분리
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Ⅰ. 기본정보
Ⅱ. 서론 (Introduction)
1. 플라스미드 (Plasmid) DNA
2. Plasmid DNA 분리
3. Plasmid DNA 정제
Ⅲ. 실험재료 및 방법 (Materials & Methods)
1. 실험재료(Materials)
2. 실험 방법(Methods)
Ⅳ. 실험결과 및 결론 (Data and Results)
Ⅴ. 고찰 (Discssion) |
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실험 제목 : 플라스미드 DNA 분리
외부에서 연구하고자 하는 DNA 조각을 plasmid에 삽입하여 연결시킨 후 박테리아에 넣어주면 이 형질 전환된 세포 내에서 DNA는 독자적으로 복제되므로 DNA 조각을 복제하는 vect or로 이용될 수 있다.
분자유전학 실험에 사용되는 plasmid는 자연계에 존재하는 plasmid의 특성부위를 조합하여 만든 plasmid가 이용된다, 이러한 plasmid는 작고 활성이 높은 relaxedreplicationorigin을 가지고 있으며 적어도 항생제 내성에 대한 한 개의 유전자를 지니고 있다.
PlasmidDNA 분리는 세균의 세포벽을 파괴하여 세균이 가진 plasmidDNA를 얻는 것 또는 어떤 plasmid 나 재조합된 plasmidDNA를 대장균 속에 넣고 대장균을 배양한 후 세포를 파괴하여 균체 내에서 증폭된 plasmid를 추출하고 정제하는 방법이다.
PlasmidDNA는 plasmid을 지니고 있는 박테리아에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다.
여기서 SDS는 박테리아 단백질을 변성시키며 NaOH는 chromosomalDNA와 plasmidDNA를 변성시킨다.
chromosomalDNA와 bacterialproteins의 대부분은 침전되며 (SDS는 potass ium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다.
chromosomalDNA는 세포막에 결합된 상태로 남아 있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmidDNA는 상등액에서 isopropanol(HolmesandQuigley, 1981)로 침전시켜 분리할 수 있다.
boilingm iniprep는 적은 양의 p lasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmidDNA는 alkalinelys isminiprep보다 품질이 떨어진다.
이번 분리 방법은 가장 빠르게 plasmidDNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용 면에 이용할 수 있는 정제된 plasmidDNA를 분리할 수 있다.
8000rpm에서 2분간 원심분리한다.
000rpm에서 10분간 원심분리한다.
원심 분리 후, tube내상층액을 DNA bindingcolumn에 넣는다.
000rpm에서 1분간 원심분리한다.
즉, 1단계는 세포를 파괴하는 용해하는 단계로 EDTA는 세포벽에 calciumion을 제거하여 세포벽을 무너뜨리는 역할을 하고, glucose는 삼투압을 유지하여 세포의 외형을 유지시켜 줍니다.
SDS는 비누 같은 계면활성제라서 지질로 되어 있는 세포막을 녹여 무너뜨리고, NaOH는 DNA를 해리시킨다.
즉, dou blestrand로 되어 있는 DNA를 singlestrand로 풀어버린다) 그런데 대장균 안에는 플라스미드 말고도 거대한 염색체 DNA가 존재하는데 SDS 처리를 하면 이것이 갈라져서 엉기게 된다.
그런데 플라스미드는 고리로 얽혀 있어서 두 strand의 DNA가 멀리 도망가지 못하니 금방 합쳐지지만 염색체 DNA는 너무 크게 엉기게 된다.
plasmidDNA는 유전공학적 실험에서 재조합 DNA 조작을 위한 vect orDNA로 사용되며 원하는 DNA 단편을 넣어 다양한 유전자 클로닝(Genecloning)과 단백질 발현 등에 널리 이용된다.
하지만, 대장균 세포 내에서 염색체 DNA와는 별도로 존재하기 때문에, plasmidDNA 분리는 염색체 DNA가 포함되지 않게 분리하는 방법이 사용된다. |
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나노헬릭스, Reliable Partner for DNA Technology, 플라스미드 (Plasmid) DNA 분리, 2013.12.03
https://m.blog.naver.com/nanohelix/70180385720
약품생화학실험, 약품생화학분과회 저, 신일북스, 2011
캠벨 생명과학 포커스 2판, Lisa A. Urry 외 4명, ㈜바이오사이언스출판, 2019
Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Sambrook and Russell.3rd Ed. 2001
Principles and Techniques of Practical Biochemistry by Wilson and Walker.5th Ed. 2000
Seize the day!, Plasmid DNA의 분리 및 정제방법
https://arwen.tistory.com/entry/52-Plasmid-DNA%EC%9D%98-%EB%B6%84%EB%A6%AC-%EB%B0%8F-%EC% |
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2023.09.25
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